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拟穴青蟹病害研究进展

郑天伦

(浙江省水产技术推广总站,浙江 杭州310012

 

关键词 拟穴青蟹;病害;研究进展

 

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)俗称青蟹,曾经被误鉴定为锯缘青蟹(S. serrata),具有生长快、肉质鲜美、营养价值高等优点,是我国东南沿海重要的经济蟹类之一。但随着青蟹养殖规模的扩大及养殖时间的推移,青蟹的病害日趋严重。

近年来,国内外学者对拟穴青蟹的病害进行了大量的研究,笔者综述了其主要研究成果。

 

1病原学

 

1.1病毒性疾病

目前,对于拟穴青蟹病毒病的研究主要集中于呼肠孤病毒、双顺反子病毒和白斑综合征病毒,另外还有一些未能分类病毒的报道。

1.1.1青蟹呼肠孤病毒

Wen%

首次自患“嗜睡病”的青蟹体内分离到1株呼肠孤病毒,直径70nm,二十面体,无囊膜,13个节段的双链RNA,电泳带型为1/5/7;具有较强的侵染性,感染此病毒的青蟹死亡率可达70%。而张叔勇等从发病青蟹中也分离到1株呼肠孤病毒,球状,直径约45nm,基因组为12个节段的双链RNA,在1%琼脂糖电泳中呈1/5/6带型。陈吉刚等通过超薄切片电镜观察,在三门县患“清水病”青蟹的鳃上皮细胞、心肌细胞、胃和肠道上皮细胞中发现了大量的呼肠孤样病毒粒子,大小约60nm,二十面体对称,无囊膜,在感染组织细胞浆中呈晶格状排列。

1.1.2青蟹双顺反子病毒

从患“嗜睡病”青蟹鳃组织中还分离到另一种病毒,人工感染青蟹的死亡率达100%。该病毒直径20~30nm,无囊膜,呈二十面体对称;病毒基因组为ssRNA,有部分双链结构,在0.8%的琼脂糖上的分子量约10.7ku,核衣壳由分子量223553ku的三种蛋白组成。由于该病毒具有双顺反子病毒科的典型特征,被命名为青蟹双顺反子病毒。2012年国际病毒分类委员会将该病毒正式命名为青蟹病毒。

1.1.3对虾白斑综合征病毒

白斑综合征病毒是拟穴青蟹的常见病毒性病原。丁朋晓在发病青蟹鳃和肠道中监测到白斑综合征病毒阳性,且检出白斑综合征病毒与青蟹发病在时间上一致。刘问2006-2008年对养殖青蟹进行调查发现,白斑综合征病毒在病蟹中的检出率为34.82%,注射感染发现,白斑综合征病毒对青蟹的半致死浓度为1.10×106拷贝/尾。周俊芳等发现,拟穴青蟹是白斑综合征病毒的自然宿主,自然携带率为8.47%;白斑综合征病毒可通过口服途径感染拟穴青蟹,并在拟穴青蟹体内快速增殖,当病毒累积到一定量后即可致死拟穴青蟹。

1.1.4其他未分类病毒

李贵生等在电镜观察下,从青蟹中肠腺上皮细胞内发现了一种不形成包涵体的杆状病毒。宋振荣等从养殖的发病青蟹肌肉组织中观察到大量的二十面体、约为150nm的球形病毒粒子。邹清等从患病青蟹组织中分离出一种球状病毒,无囊膜,不形成包涵体,直径50~60nm,与呼肠孤病毒相似,该病毒核酸对DNase不敏感,对RNase敏感,但电泳不出现明显分节段的条带。李丹等在发病青蟹细胞质中发现有长约500nm、宽约200nm的疑似杆状病毒,与已有报道的青蟹病毒特征均不同。

 

1.2细菌性疾病

纪荣兴等从患“黄体病”的青蟹心脏血淋巴中分离出一株细菌,经鉴定为非液化摩拉氏菌(Moraxella nomliquefaciens)。毛芝娟等从患病青蟹体内分离到辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis )、溶藻弧菌(V. alginolyticus)和副溶血性弧菌(V. parahaemolyticus)。陈华从病蟹中分离到1株副溶血性弧菌,以9.0×106/尾的菌数注射青蟹,青蟹100%死亡。夏小安等从患病青蟹中分离纯化到2株优势细菌!通过基因序列同源性比对和系统发育树分析,结合细菌生理生化特性分析,分别被鉴定为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和副溶血弧菌。王海潮等从患“黄水病”的青蟹体内分离出28株细菌,经鉴定均为弧菌科细菌,其中嗜水气单胞菌12株、辛辛那提弧菌8株、副溶血弧菌5株、温和气单胞菌(A. sobra3株。以上分离的所有细菌,经人工感染均可复制症状并致青蟹死亡,故均为青蟹的病原菌。此外,已经报道的青蟹细菌性疾病还有河弧菌病、丝状细菌病、甲壳溃疡病、黑鳃病、黄斑病等。

 

1.3寄生虫病

常见的青蟹寄生虫有蟹奴、海鞘、线虫、固着类纤毛虫、茗荷儿、藤壶等。通常该类病害的死亡率不高,但可导致青蟹生长欠佳,影响青蟹的商品价值,或继发感染其他病害。许文军等通过大量取样发现,所有患“黄水病”病蟹的血淋巴和组织中均发现大量的寄生原虫,经过病原、组织病理、电镜观察以及分子生物学方法,确定为血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.),是养殖青蟹“黄水病”的重要病原。

 

1.4环境因素造成的病害

已报道的主要由环境因素造成的青蟹病害有蜕壳不遂、饱水病、白芒病、黄芒病、红芒病、黄斑病等,主要原因是青蟹养殖过程中,天气、水温、水质及盐度的突变。

 

2理学研究

 

关于青蟹的病理学研究已有较多报道。宋振荣等研究了青蟹肌肉浊白的组织病理学,发现病蟹的肌纤维断裂、肌细胞坏死溶解、细胞核萎缩和空泡变性,在肌肉组织中存在大量的二十面体、约150nm的球形病毒粒子,该病毒为锯缘青蟹肌肉坏死症的病原体。李丹等利用光学显微镜观察,发现患病青蟹中肠腺上皮细胞组织中有大型的包涵体存在,细胞坏死呈空泡状、溶解;电子显微镜观察可见肌肉细胞小器官明显减少、核质周缘变性,在中肠腺细胞中可见疑似杆状病毒。

熊娟等研究了感染呼肠孤病毒青蟹的组织病理学!病蟹的肝胰腺、鳃组织和肠组织的病理变化最明显,如肝胰腺基底膜破损、肝细胞坏死,鳃腔堵塞,肠上皮细胞脱落,心肌与足肌纤维排列紊乱、断裂等;超薄切片显示病毒在肝胰腺、鳃、肠、心脏等组织广泛分布,导致靶器官细胞核染色质凝结、电子密度增高、髓样小体和溶酶体产生、线粒体组织结构破坏和粗面内质网扩张变形等明显细胞病理学变化。

夏小安等研究了由细菌和寄生原虫引起的患“黄水病”青蟹的组织病理学,发现两者在组织病理变化上非常相似:病蟹肝细胞水肿,变性;肝管上皮细胞间界线模糊、消失,肝管细胞坏死;心肌局部坏死,细胞边界模糊;鳃丝变性,鳃上皮细胞水肿变性,鳃腔扩张;足部肌肉的肌纤维断裂、间隙增大,局部坏死。不同的是,前者鳃腔内出现病菌形成的集落,后者观察到大量寄生的血卵涡鞭虫。

除组织病理外,还有学者研究了青蟹的血液病理。患“黄水病”青蟹血清中的尿素氮和肌酐含量极显著高于健康蟹,而甘油三酯和总胆固醇则极显著低于健康蟹;蛋白质含量和谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷酰转肽酶和乳酸脱氢酶活性皆极显著低于对照组,电解质仅Mg2+极显著高于对照组,说明病蟹的营养物质代谢异常,抗病力、消化、呼吸、排泄等生理功能受到损害。

 

3免疫学研究

 

青蟹的免疫系统为非特异性免疫,包括细胞免疫和体液免疫,目前已克隆出抗氧化蛋白、模式识别蛋白、抗菌肽和酚氧化酶系统等与青蟹免疫相关的基因。戴聪杰等通过测试青蟹血清和肌肉提取液!推测青蟹的血清与肌肉都含有不同种类凝集素。刘文杰等发现,青蟹感染副溶血弧菌后,血淋巴中出现1条明显差异条带,肽质量指纹图谱及生物信息分析表明,该蛋白为cryptocyanin,是血蓝蛋白基因家族中的重要成员,与青蟹免疫反应有关。苏静等给青蟹分别注射生理盐水、副溶血弧菌、鳗弧菌(V. anguillarum)和嗜水气单胞菌,比较各组肌肉蛋白的双向电泳图谱获得三个差异表达的蛋白,鉴定为Calexcitin、无翅蛋白片断、速激肽相关肽。

目前学者已经集中研究了呼肠孤病毒、白斑综合征病毒、黄水病、温度、pH、氨氮、抗菌药物、镉、铬胁迫等对青蟹血细胞密度、3种血细胞比例、血细胞吞噬百分比和吞噬指数、血清溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、酚氧化酶、过氧化物酶酶活性等免疫指标的影响。潘清清等试验结果表明,青蟹酚氧化酶的最适作用温度为25,最适pH值为7.8;十二烷基硫酸钠、Ca2+Mg2+均可提高酚氧化酶的活力,其中Ca2+Mg2+的最佳反应浓度分别为50mmol/L150mmol/1,十二烷基硫酸钠的最佳反应质量浓度为2.5

mg/mL;叠氮钠、二乙基二硫代氨基甲酸钠、乙二胺四乙酸、Ca2+对酚氧化酶活力有不同的抑制作用;拟态弧菌、(V. minicus)和气单胞菌对酚氧化酶激活作用显著,金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、壁微球菌(Micrococcus lysodeikicus)对酚氧化酶有弱激活作用;肽聚糖和拟态弧菌脂多糖粗提物可显著提高酚氧化酶活力,最佳激活质量浓度分别为2.70.5mg/mL

 

4诊断技术研究

 

检测技术研究主要集中在青蟹病毒上。郭志勋建立了呼肠孤病毒和双顺反子病毒的套式RT-PCR检测技术,灵敏度可达pg。区宇洁建立了呼肠孤病毒和双顺反子病毒的特异性巢式PCR方法和荧光实时定量PCR方法。Chen等建立了呼肠孤病毒的RT-LAMP法。肖樊建立了呼肠孤病毒的RT-PCR法。张迪等利用呼肠孤病毒和双顺反子病毒基因保守区设计了4对引物,建立了可同时检测这两种病毒的双重巢式PCR检测方法,对两种病毒的检测限均可达到10个拷贝,并与白斑综合征病毒等6种水生动物常见病毒无交叉反应,特异性强。

此外,施慧等设计了一对针对血卵涡鞭虫ITS1基因序列的特异性引物,成功建立了青蟹血卵涡鞭虫的PCR检测方法。谢建军等以血卵涡鞭虫体为抗原,制备了多克隆血清抗体,建立了血卵涡鞭虫的间接荧光抗体检测技术;采用间接荧光抗体检测技术和PCR法检测采集的养殖青蟹、梭子蟹(Portunus trituberculatus)及海捕梭子蟹等18个样本,结果显示两者符合率达100%;阳性虫体染上黄绿色荧光,而正常梭子蟹血细胞则未被染色;可检测到血卵涡鞭虫的营养体、腰鞭孢子及合孢体等不同生活阶段,为血卵涡鞭虫的流行病学调查及生活史研究提供了简便实用的方法。

 

5流行病学研究

 

区宇洁2008-2010年对养殖青蟹检测结果表明,呼肠孤病毒感染率高,超过43%,双顺反子病毒的感染率在超过2%;检测出有双顺反子病毒的青蟹均能检出呼肠孤病毒,但检出有呼肠孤病毒的青蟹不一定有双顺反子病毒。彭银辉等对养殖拟穴青蟹病原携带情况进行调查时,发现细菌性病原以副溶血弧菌和溶藻弧菌为主,病毒性病原中白斑综合症病毒阳性检出率为4.94%、双顺反子病毒为3.70%,呼肠孤病毒阳性检出率的比例较前二者高,达25.93%,弧菌和呼肠孤病毒为健康拟穴青蟹携带的主要病毒性病原。

黄诗婷等比较研究了4个拟穴青蟹养殖池水环境中细菌群落结构,不同养殖水环境中优势菌种、特有菌种不同。蔡丽萍等采用PCR-DGGE技术分析了7个地区的青蟹肠道菌群的群落结构,结果显示青蟹肠道菌群的结构多样性差异较大,且同一地区雌雄样本的肠道菌群相似性也有差异。冯振飞等研究了青蟹养殖环境中细菌类群及其数量的垂直与季节变化规律,异养细菌的组成类群在水体与底泥中基本相似,但水体以革兰氏阴性菌为主,占87.2%,底泥中以革兰氏阳性菌为主,占64.5%9月水体中菌量达到高峰,底泥中菌量高峰出现在11月;9月水体中弧菌量达到高峰,9-10月底泥中弧菌维持在较高水平;9-11月初氨化细菌、反硝化细菌、硫酸还原菌在均维持较高水平,三者在底泥中于11月初达到高峰。

吴清洋等对青蟹养殖区的环境因素进行了连续监测,发现水体理化因子的恶化和条件致病微生物的大量增生是青蟹病害爆发的重要原因。冯振飞等分析研究了锯缘青蟹发病与养殖环境因子的关系,发现盐度变化、降雨量和弧菌数量等3个环境因子显著影响黄水病的发生与流行。

 

6防治技术研究

 

对青蟹病害的防治技术研究主要集中于药物方面。纪荣兴等报道,部分磺胺类和氨基糖普类药物对非液化摩拉氏菌有较强的抑制作用,可加以选用。毛芝娟等发现辛辛那提弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌对环丙沙星和硫酸庆大霉素等抗菌素敏感性高,中草药五倍子及其煎出液对3种弧菌均有较强的抑菌性能,可用于治疗该病。夏小安等发现,从病蟹体内分离到的嗜水气单胞菌和副溶血弧菌,均对阿莫西林、氧氟沙星、庆大霉素、链霉素高度敏感;采用嗜水气单胞菌浸泡感染或注射感染青蟹,发病后用阿莫西林药浴3d,疗效100%

谢丽玲等研究发现,大黄、黄芩、金银花、杜仲与大枣及其复方对青蟹副溶血弧菌和嗜水气单胞菌有良好的抑菌效果,能用于青蟹疾病的治疗。邱庆连等测试了45种中草药对青蟹病原菌拟态弧菌、梅氏弧菌(V. metschnikovii)和霍利斯弧菌(v. houisae)的体外抑菌效果,有28种中药提取物对试验弧菌有抑菌作用,其中五倍子、乌梅、秦皮、艾叶中药提取物抑菌作用较好,对3种菌株均有较好的抑制效果;测定了五倍子、乌梅和天冬3种药物对拟态弧菌和梅氏弧菌的最低抑菌浓度分别为0.1720.4611.042mg/mL,对霍利斯弧菌的最低抑菌浓度分别为0.0860.9221.042mg/mL

 

7展望

 

今后的研究工作应该重点关注以下几个方面:

1)早期诊断和预警预报技术研究。青蟹病害,尤其是病毒性疾病,发病初期症状不显著,当出现明显症状时,青蟹往往已经濒临死亡。开发早期快速诊断技术和病害预警预报技术尤其重要。

2)发病机理研究。只有搞清楚了各种青蟹疾病的发病机理,才能进一步有针对性地研究药物、免疫乃至生态防治方法。

3)健康养殖模式和技术研究。

4)抗病育种研究。加强青蟹机体本身的抗病能力最重要。除了在饲料中强化营养、添加免疫增强剂之外,针对特定病原开展抗病育种研究,是彻底解决病害困扰的方法。

(参考文献略)

 

(信息来源:《水产科学》2014.5

 

 

 

 



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